Preparação das lâminas

    TÉCNICAS HISTOLÓGICAS

  A correta observação do material biológico, em microscopia óptica, implica uma série de procedimentos técnicos prévios, que a seguir se descrevem sumariamente. Estes procedimentos, designam-se genericamente por técnicas histológicas.

  A técnica histológica visa à preparação dos tecidos destinados ao estudado à microscopia de luz. O exame ao microscópio é feito geralmente por luz transmitida, o que significa que a luz deve atravessar o objeto a ser examinado. Assim, é necessária a obtenção de fragmentos dos tecidos que serão coletados em lâminas muito finas e transparentes.

  Muitas são as técnicas utilizadas em histologia. Algumas técnicas freqüentemente são utilizadas em rotinas de laboratórios que proporcionam a visualização das microestruturas dos tecidos.

• Confecção de Lâminas Histológicas

  Para a análise sob microscopia óptica é necessária a confecção de lâminas delgadas dos tecidos que formam os órgãos. Estas lâminas podem ser permanentes ou provisórias.

• Coleta do Material

  Partes de órgãos são retiradas com o auxílio de um bisturi, pinça ou lâmina de barbear. Não é indicada a extração de porções grandes, uma vez que o objetivo final é a obtenção de uma camada fina que possa ser analisada em um microscópio óptico.

• Fixação do material

  Esta etapa consiste na utilização de procedimentos físicos ou químicos para imobilizar as substâncias constituintes das células e dos tecidos, fornecendo maior resistência para suportar as demais etapas. Além disso, os fixadores retardam os efeitos pos-mortem do tecido, mantendo sua arquitetura normal.

  Os agentes fixadores mais utilizados são o formol tamponado e o líquido de Bouin. Ambos fixam as proteínas evitando sua degradação.

  O formol, por ser mais acessível e de uso simples, é o fixador mais utilizado nas técnicas histológicas. Contudo, seus resultados geralmente não são satisfatórios. Por essa razão é recomendada a dissolução de formol em tampão fosfatado (Junqueira e Junqueira, 1983).

  O tempo de fixação dependerá do tamanho do fragmento do tecido, podendo variar entre 06 e 24h. É recomendado que, sempre que possível, não ultrapasse a 3 mm de espessura.

• Inclusão

  Este procedimento consiste na impregnação do tecido com uma substância de consistência firme que permita, posteriormente, seccioná-lo em camadas delgadas. Pelo fácil manuseio e bons resultados, a parafina é a mais utilizada neste procedimento. Como ela não é miscível em água, a primeira etapa da inclusão compreende a desidratação, quando ocorre a retirada da água dos tecidos e a sua substituição por álcool.

  A diafanização é a etapa seguinte, com a substituição do álcool, agora presente nos tecidos, por xilol. Finalmente, na impregnação, última etapa, o xilol é substituído por parafina fundida a 60° em pequenos blocos. Neste momento a catalogação do bloco é importante para a posterior identificação da peça.

• Microtomia

  Esta etapa consiste, basicamente, em utilizar um micrótomo para obter cortes

 sucessivos, delgados e uniformes, a partir dos blocos de parafina com as peças incluídas. Este aparelho é formado por uma lâmina (fixa ou descartável) de aço, afiada, e um braço ao qual se prende o bloco e que se desloca verticalmente.

Micrótomo (tipo “rotativo”) e operação de corte

  É difícil obter cortes abaixo de 3 a 4 micrômetros de espessura dos materiais incluídos em parafina.De um modo geral, são obtidos cortes entre 5 e 7 micrômetros.

• Montagem das lâminas histológicas

  As fitas obtidas a partir do micrótomo são transferidas para um banho-maria, com o auxílio de uma pinça, para serem distendidas (Fig. 1 B). A água deve estar entre 3° e 8º abaixo do ponto de fusão da parafina utilizada.

  Nesta etapa, são retiradas as dobras e evitadas as bolhas abaixo da fita. Após a distensão, os cortes são separados individualmente ou em grupos, conforme a conveniência, utilizando se lâminas de vidro previamente limpas com detergente, estocadas em álcool 80% e previamente secas. Antes da utilização das lâminas, é necessário revestir suas superfícies com uma fina camada de albumina para facilitar a adesão da peça.

  Os cortes obtidos podem ser transferidos, inicialmente, para uma estufa onde ficam alguns minutos (não mais que dez minutos) para posteriormente serem colocados em um suporte inclinado.Finalmente, os cortes devem ser depositados em uma estufa a 60º para secagem entre uma e 24 horas.

Técnica de Criomicrotomia (= Microtomia por Congelamento)

  A técnica descrita acima, sem dúvida, é a mais utilizada. Contudo, em alguns casos, esta técnica é contra-indicada, como, por exemplo, no estudo da distribuição dos lipídios, em técnicas histoquímicas avançadas ou quando são necessários cortes urgentes, como em exames patológicos. Nestes casos, os tecidos são endurecidos através do congelamento. Os aparelhos utilizados para os cortes podem ser de dois tipos: micrótomos de congelamento ou criostatos (Junqueira e Junqueira, 1983).

  O criostato é um aparelho mais aperfeiçoado que o anterior. Permite a obtenção de cortes muito mais finos de tecidos não fixados (até dois micrômetros), facilitando a visualização das células (Junqueira e Junqueira, 1983).

Referências:

Marques,A.F. Definição de histologia. [S.I] : Universidade Federal do Sergipe,2009.Disponível em:
< http://www.ebah.com.br/content/ABAAAAW4EAG/tecnicas-histologicas >.Acesso em 21 de mar. 2012.