Técnicas de coloração

Técnicas de Coloração de Cortes Histológicos

A coloração consiste numa etapa muito importante para a visualização das estruturas do tecido. Normalmente são utilizados corantes hidrossolúveis, sendo necessário, deste modo, a remoção da parafina da peça que foi preparada nas etapas descritas anteriormente e que permanece na lâmina de vidro.

Existem muitos tipos de corantes, mas de um modo geral podem ser agrupados em três classes distintas (Gartner e Hiatt, 1999):

• Corantes que diferenciam os componentes ácidos e básicos das células;
• Corantes especializados que diferenciam os componentes fibrosos da matriz extracelular;
• Sais metálicos que precipitam nos tecidos.

Os corantes mais utilizados nos procedimentos histológicos são a Hematoxilina e a Eosina (HE).

A Hematoxilina é uma base que cora, preferencialmente, componentes ácidos das células em um tom azulado escuro. Como os componentes ácidos mais abundantes são o DNA e o RNA, tanto o núcleo, quanto certas partes do citoplasma, se tornam azulados. Esses componentes são chamados de basófilos.

A Eosina, ao contrário, é um ácido que cora as estruturas básicas da célula de rosa. Estas estruturas são abundantes no citoplasma e são chamadas de acidófilas (Gartner e Hiatt, 1999).

Outros corantes são também utilizados em procedimentos de rotina em laboratórios, tais como (Gartner e Hiatt, 1999):

• Tricrômico de Masson - cora o núcleo de azul escuro, o citoplasma, a queratina e o músculo de vermelho e o mucigênio e o colágeno de azul claro;
• Orceína - cora as fibras elásticas de marrom;
• Weigert - cora as fibras elásticas de azul;
• Prata - cora as fibras reticulares de preto;
• Hematoxilina férrica - cora as estriações dos músculos, os núcleos e os eritrócitos de preto;
• Ácido periódico reativo de Schiff – cora as moléculas ricas em glicogênio e carboidrato de magenta;
• Wright e Giemsa - especializado em células sangüíneas, cora de rosa os eritrócitos e os grânulos eosinófilos, de púrpura o núcleo dos leucócitos e grânulos basófilos e de azul o citoplasma dos monócitos e dos linfócitos.

Para corar peças incluídas em parafina é necessária a retirada da parafina e a hidratação da peça.

Este procedimento é realizado a partir de uma seqüência de banhos em xilol, álcool e água, inversamente ao procedimento executado na etapa de inclusão.

Após a hidratação, os cortes são corados de acordo com o procedimento mais apropriado para a análise que será realizada posteriormente.

Aqui serão abordadas as etapas do método da hematoxilina-eosina, por ser o mais utilizado e por ter um resultado final satisfatório.

• Técnica da hematoxilina-eosina (HE)

a) Material necessário para a solução de Hematoxilina de Harris (Junqueira e Junqueira, 1983):

- Hematoxilina ______________________ 2,5g

- Álcool 100% _____________________ 25ml

- Alúmen de amônio ou potássio ______ 50g

- Água destilada ___________________ 500ml

- Óxido vermelho de mercúrio _______ 1,25g

- Ácido acético _____________________ 20ml

Inicialmente, a Hematoxilina deve ser dissolvida no álcool e o alúmen na água destilada (previamente aquecida). Posteriormente, as duas soluções devem ser misturadas e aquecidas até a fervura.

O óxido de mercúrio é adicionado à solução que deve ser resfriada, mergulhando-se o frasco em água fria. O ácido acético é então colocado na solução fria para finalmente ser filtrada. O prazo de envelhecimento desta solução é entre dois e três meses. A partir desta data o corante perde suas propriedades e não reage adequadamente com o tecido.

b) Material necessário para a Eosina (Junqueira e Junqueira, 1983):

- Eosina solúvel em água _______________ 1g

- Água destilada ___________________ 100ml

c) Procedimentos para a coloração:

Embora as etapas possam ser definidas, o tempo em cada fase depende da qualidade e da idade das soluções dos corantes. Deste modo, poderá ser observada nas etapas abaixo uma variação muito grande em relação ao tempo que pode ser ajustado durante o procedimento no laboratório.

De acordo com Junqueira e Junqueira (1983), as etapas são:

1º) desparafinar e hidratar os cortes;

2º) corar em hematoxilina entre 5 e 15min;

3º) lavar em água corrente por 10min;

4º) corar em eosina entre 1 e 10min;

5º) lavar em água e desidratar em álcool 70% rapidamente;

6º) diafanizar e montar em resina.

d) Montagem Final da Lâmina:

Este processo consiste em depositar uma gota de resina líquida sobre o corte que está aderido à lâmina de vidro e cobri-lo com uma lamínula. Nesta etapa deve-se evitar as bolhas de ar que se formam na resina durante a colocação da lamínula. Finalmente a lâmina é catalogada.

A resina depois de seca garantirá uma lâmina permanente que poderá durar anos.

Referências:

Marques,A.F. Definição de histologia. [S.I] : Universidade Federal do Sergipe,2009.Disponível em:
< http://www.ebah.com.br/content/ABAAAAW4EAG/tecnicas-histologicas >.Acesso em 21 de mar. 2012.